Serina ADP

Nature Communications volume 14, Número do artigo: 3200 (2023) Cite este artigo

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Na resposta ao dano do DNA de mamíferos, a sinalização de ADP-ribosilação é de importância crucial para marcar os locais de dano ao DNA, bem como recrutar e regular os fatores de reparo. Especificamente, o complexo PARP1:HPF1 reconhece DNA danificado e catalisa a formação de marcas de ADP-ribosilação ligadas a serina (mono-Ser-ADPr), que são estendidas em polímeros de ADP-ribose (poli-Ser-ADPr) apenas por PARP1. Poly-Ser-ADPr é revertido por PARG, enquanto o terminal mono-Ser-ADPr é removido por ARH3. Apesar de sua importância e aparente conservação evolutiva, pouco se sabe sobre a sinalização de ADP-ribosilação em animais não mamíferos. A presença de HPF1, mas ausência de ARH3, em alguns genomas de insetos, incluindo espécies de Drosophila, levanta questões sobre a existência e reversão da serina-ADP-ribosilação nessas espécies. Aqui mostramos por proteômica quantitativa que Ser-ADPr é a principal forma de ADP-ribosilação na resposta ao dano do DNA de Drosophila melanogaster e é dependente do complexo dParp1:dHpf1. Além disso, nossas investigações estruturais e bioquímicas revelam o mecanismo de remoção do mono-Ser-ADPr pela Drosophila Parg. Coletivamente, nossos dados revelam Ser-ADPr mediado por PARP:HPF1 como uma característica definidora do DDR em Animalia. A impressionante conservação dentro deste reino sugere que organismos que carregam apenas um conjunto central de enzimas metabolizadoras de ADP-ribosil, como Drosophila, são organismos modelo valiosos para estudar o papel fisiológico da sinalização Ser-ADPr.

A ADP-ribosilação (ADPr) é uma modificação pós-traducional de proteínas que envolve a transferência de porções ADP-ribose do NAD+ para uma proteína alvo. Está envolvido na regulação de diversos processos celulares, como reparo do DNA, regulação transcricional, imunidade, metabolismo microbiano, entre outros1,2,3,4. As unidades ADP-ribose podem ser ligadas a uma variedade de cadeias laterais de aminoácidos, entre outras, com funcionalidades ácidas (Glu/Asp), básicas (Arg/Lys), hidroxilas (Ser/Tyr) e tiol (Cys)2,5. Alguns escritores, como PARP1, PARP2 e tankyrase1/2 (também denominado PARP5a/b) podem estender a modificação inicial conhecida como mono(ADP-ribosilação) (MARylation) e criar polímeros de ADP-ribose lineares ou ramificados conhecidos como poli(ADP -ribosilação) (PARilação)6,7,8.

A ligação de PARP1/2 induz a proteína ADPr dependente de PARP1/2 em quebras de DNA, o que dá origem a sinais de ADPr que ativam e controlam uma variedade de mecanismos de resposta a dano de DNA (DDR) necessários para a descompactação da cromatina e o recrutamento de fatores de reparo4 ,9. Estudos anteriores mostraram que PARP1 e PARP2 catalisam a modificação do glutamato/aspartato in vitro10, enquanto a análise espectrométrica de massa revelou que a serina-ADPr é o principal resíduo modificado pelo ADPr durante o dano ao DNA em células humanas11,12,13,14. Essa discrepância foi resolvida com a descoberta da proteína auxiliar, fator 1 de PARilação de histonas (HPF1)11,15, que completa o sítio ativo de PARP1/2 contribuindo com resíduos catalíticos e de ligação ao substrato16,17,18. Além disso, o complexo PARP1/2:HPF1 também é responsável pela modificação menos compreendida dos resíduos de tirosina19,20.

O ADPr é altamente dinâmico e deve ser mantido estritamente regulado devido ao alto gasto de energia associado. Portanto, uma vez alcançada uma resposta celular adequada, a sinalização do ADPr cessa e as unidades de ADP-ribose utilizadas são recicladas por apagadores especializados que convertem o ADP-ribose em outros nucleotídeos, incluindo ATP e NAD+21. A principal enzima responsável pela degradação da maior parte das cadeias PAR é a poli(ADP-ribose)glicohidrolase (PARG), que hidrolisa a ligação acetal dentro do polímero ADP-ribose, mas não consegue reverter a ligação proteína-ribose22,23,24. Nas células humanas, essa reação específica, a remoção do Ser-ADPr, é realizada pela (ADP-ribosil)hidrolase 3 (ARH3)23,25.

0.9), corresponding to 296 ADPr target proteins in Drosophila S2R+ cells (Fig. 3B, C and Supplementary Data 2). Reassuringly, the data demonstrated good localisation probability with >75% of the ADPr peptide spectrum matches (PSMs) possessing a localisation probability > 90% (Supplementary Fig. 2A). Overall, we observed a high degree of reproducibility between our experimental replicates, with the most variation present in the H2O2-treated samples (Fig. 3C, D and Supplementary Fig. 2B)./p>

500 high confident ADPr sites. Previously, ADPr has been reported to modify aspartic acid, glutamic acid, lysine, and arginine residues52,65,66. The relatively recent discovery of serine residues as acceptor sites13, has led to the identification of serine as the most abundantly modified amino acid residue under DNA damage in cell culture12,14. By combining the Af1521 enrichment strategy, which is able to identify ADPr on all possible amino acid residues50,67,68, with ETD fragmentation for proper localisation of the modification site12, we identified serine as the most abundantly modified residue in Drosophila under these experimental conditions. Still, experimental conditions as well as the depth of sequencing could cause the absence of other known amino acid acceptor residues. Our analysis of the Ser-ADPr cycle in D. melanogaster further revealed a striking conservation with the human signalling pathway. On the molecular level not only the mammalian ADPr consensus motif ‘KS’ is conserved, but we observe a broad overlap with previously identified ADPr targets in humans. This is particularly true for the main ADP-ribose acceptors such as PARP1 and histones. In both species, pathways relevant for genome stability, chromatin structure regulation, and transcription are major targets for this modification. Thus, our data suggests that Drosophila can serve as a model organism to provide insights into the physiological function of Ser-ADPr signalling. This includes the possibility of understanding the links between this modification and associated diseases including neurodegeneration and cancer30,41,69,70,71. In this respect, it was previously shown that dParg deficiency could be complemented using human ARH3 gene71. Also, as the hPARP1 automodification region that has been shown to be important for hPARP1 trapping at DNA breaks and the PARP inhibitor response in humans is functionally conserved in Drosophila species (Fig. 4G and Supplementary Fig. 4), this model could be useful for understanding the physiological effects of clinically relevant PARP inhibitors30./p>

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